从筛选的菌株中成功克隆出Inu1、Inu2两个外切菊粉酶基因:Inu1(MW355866)包含一个1482 bp的开放阅读框,可编码493个氨基酸;Inu2(MW355867)基因序列中有一个2616 bp的开放阅读框,编码871个氨基酸。将Inu1/2基因分别转化至毕赤酵母中,经过甲醇诱导表达出重组菊粉酶INU1/2。INU1在发酵培养24小时后显示出0.32 U/mL的菊粉酶活性,INU2的酶活性在培养36小时后达到峰值,可达6.15 U/mL。对重组菊粉酶进行了SDS-PAGE分析,纯化的INU1分子量约为59.0 kDa,纯化的INU2分子量约为100 kDa,均与其预测分子量相符,这也验证了重组蛋白INU1和INU2的成功表达。 纯化的重组菊粉酶INU1在pH为6,30 ℃的条件下水解菊粉的能力最高,达到0.45 U/mg,添加1 mM MgSO4·5H2O 的处理组与未添加金属离子的对照组酶活相比提升了约10 %,Cu2+ 和 Fe3+使INU1完全失活。纯化的重组菊粉酶INU2在pH为6, 45 ℃的条件下水解菊粉的能力最高,达到46.3 U/mg,添加1 mM LiCl对INU2酶活的促进作用最大,其活性与未添加金属离子的对照相比增加近20 %,Fe2+、Zn2+、Cu2+和Fe3+对INU2酶活起抑制作用。纯化的重组菊粉酶INU1和INU2均能水解利云型果聚糖和菊粉,在水解短链菊糖分子时,INU1似乎具有较强的水解活性,而在水解长链菊糖分子时水解能力较低。INU2对于长短链菊糖分子的水解能力与INU1相反,这一结果可能表明INU1与INU2对菊粉水解具有一定协同作用。
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